THCA synthase from Cannabis sativa L. - a biocatalyst for the production of cannabinoids

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Die vorliegende Arbeit untersucht das Potenzial und den zellfreien Einsatz der FAD-abhängigen Oxidase Δ9-Tetrahydrocannabinolsäure Synthase (THCAS), einem Enzym aus dem Sekundärmetabolismus der Cannabis sativa L. THCAS katalysiert die Bildung einer intramolekularen C-C Bindung von Cannabigerolsäure (CBGA) zu Δ9-Tetrahydrocannabinolsäure (THCA), wobei Sauerstoff als Elektronenakzeptor fungiert. Pichia pastoris erwies sich als vorteilhafter Wirtsstamm für die funktionale Genexpression im Vergleich zu Escherichia coli, wo die Produktion des Enzyms in inaktiven Inklusionskörpern resultierte. Im Gegensatz dazu konnten aus dem Überstand von P. pastoris zwei aktive Enzymkonformationen isoliert werden, mithilfe eines einfachen Isolationsprotokolls aus Dialyse und Kationenaustauschchromatographie. Die Produktivität der THCAS wurde durch die Kinetik und die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Reaktanden beeinflusst, konnte jedoch durch Optimierung der Substratlöslichkeit und Proteinkonzentration verzehnfacht werden. Besonders vorteilhaft war die Etablierung eines Zweiphasensystems mit Hexan. Eine quantitative Prozessevaluierung zeigte, dass die erzielte Produktivität und Produktkonzentration von THCA mit industriellen Prozessen zur Herstellung von Feinchemikalien vergleichbar ist. Diese Arbeit legt die Grundlage für die zellfreie biokatalytische Produktion komplexer und hydrophober Spezialitäten wie THCA im Gramm-Maßstab.