Charakterisierung des genetisch kodierten Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Sensors „Mermaid“ zur Messung einer Änderung des Plasmamembranpotentials pulmonalarterieller glatter Muskelzellen unter hypoxischen Bedingungen

Más información sobre el libro

Die hypoxische pulmonale Vasokonstriktion optimiert die Oxygenierung des Blutes bei alveolärer Hypoxie, indem Blut von schlecht belüfteten zu gut belüfteten Lungenbereichen umverteilt wird. Präkapilläre pulmonalarterielle glatte Muskelzellen (PASMC) sind die Sensor- und Effektorzellen dieses Mechanismus. Der Ionenkanal TRPC6 spielt eine zentrale Rolle in der ersten akuten Phase der HPV, doch die Signaltransduktionskaskade ist noch nicht vollständig entschlüsselt. Ziel der Arbeit war die Charakterisierung von Mermaid zur Messung von Membranspannungsänderungen in Maus-PASMC, die aus einer Hypoxie-induzierten TRPC6-Aktivierung resultieren, um die Signaltransduktionskaskade weiter zu entschlüsseln. Maus-PASMC wurden isoliert und mit Lentiviren infiziert, die den FRET-Sensor enthielten. Nach der Expression des Sensors in der Plasmamembran wurde die Sensorreaktion auf Membranspannungsänderungen untersucht. Die Verifizierung der Sensorfunktionalität mit KCl zeigte nur bei höheren Konzentrationen eine gute Unterscheidbarkeit, während die schwächste Konzentration keinen signifikanten Unterschied aufwies. Die direkte Aktivierung von TRPC6 mit OAG ergab keine messbare Membranspannungsänderung. Auch Hypoxie in Kombination mit dem Vasokonstriktor ET-1 zeigte keine messbare Änderung im Vergleich zu normoxischen Kontrollen. Die Hypoxie-induzierte Membranspannungsänderung wurde jedoch mithilfe der Fura 2 AM basierten Mangan-Quenching Methode